ردیابی و تعیین خصوصیات مولکولی عوامل فایتوپلاسمایی انگور در منطقه مرکزی ایران

فایتوپلاسماها به عنوان یکی از مهم ترین عوامل ایجادکننده بیماری در روی گیاهان، خسارات فراوانی به انگور در سراسر جهان وارد می کنند. طی سال های اخیر در مناطق مرکزی ایران علائم پیچیدگی، زردی و ارغوانی شدن برگ درختان مو مشاهده شد که با علائم بیماری های فایتوپلاسمایی شباهت داشت. به منظور شناسایی و گروه بندی فایتوپلاسماهای آلوده کننده انگور منطقه مرکزی ایران، نمونه هایی با علائم فایتوپلاسمایی جمع آوری شد و استخراج dna از رگبرگ نمونه ها صورت گرفت. برای ردیابی فایتوپلاسما در نمونه ها از واکنش pcr با جفت آغازگر های عمومی ناحیه 16s rrna فایتوپلاسماها استفاده شد. به این منظور در واکنش pcr دور اول، جفت آغازگر های p1/p7 و p1a/p7a استفاده شدند. با استفاده از آغازگر p1/p7 در تعداد محدودی از نمونه ها قطعه bp 1784 تکثیر شد، ولی استفاده از آغازگر p1a/p7a منجر به تکثیر قطعه bp 1759 در تعداد بیشتری از نمونه ها شد. برای تکثیر نواحی مشخصی از قسمت داخلی ناحیه 16s-23s rrna تکنیک nested-pcr با استفاده از جفت آغازگر r16f2n/r16r2 به کار گرفته شد. استفاده از جفت آغازگر r16f2n/r2 در nested-pcr بعد از pcr دور اول با جفت آغازگرهای p1/p7 و p1a/p7a منجر به تکثیر قطعه bp 1239 در تعداد زیادی از نمونه های جمع آوری شده در اواخر تابستان و اوایل پاییز شد، ولی تکثیر قطعه مورد نظر در نمونه های بهاره و اوایل تابستان موفقیت آمیز نبود. برای بررسی بیشتر این نمونه ها از جفت آغازگرهای fuu5/ru3، pa2f/r و npa2f/r در nested-pcr از محصول pcr جفت آغازگر p1a/p7a استفاده شد. استفاده از جفت آغازگرها fuu5/ru3، pa2f/r و npa2f/r در نمونه های مثبت منجر به تکثیر قطعات bp 876، bp 1178 و bp 485 شد. بر اساس این نتایج استفاده از جفت آغازگرهای fuu5/ru3، pa2f/r و npa2f/r برای ردیابی فیتوپلاسمای انگور مناسب تشخیص داده شد ولی ترکیب جفت آغازگر p1a/p7a در pcr دور اول و r16f2n/r2 در دور دوم بهترین روش برای ردیابی فایتوپلاسماهای انگور ارزیابی گردید. به منظور شناسایی جدایه های عامل بیماری در نمونه های انگور جمع آوری شده، از آزمون pcr-rflp استفاده شد. به این منظور یک قطعه bp 1239 با استفاده از جفت آغازگر r16f2n/r2 در واکنش nested-pcr در جدایه های مختلف تکثیر شد و سپس این قطعه توسط آنزیم های برشی hea???، hinf?، mse?، msp?(hap??)، rsa? و taq? مورد هضم آنزیمی قرار گرفت. بر اساس این آزمون، جدایه های فایتوپلاسمایی در دو گروه ? و ?? طبقه بندی شدند. بر اساس آزمون pcr-rflp ده جدایه از مناطق، گهرود، سامان و فرخ شهر استان چهارمحال و بختیاری ، تیران و شهرضای استان اصفهان، ملایر استان همدان و مروست استان یزد به عنوان نماینده برای تعیین توالی نوکلئوتیدی انتخاب گردیدند. مقایسه توالی های نوکلئوتیدی این جدایه ها با توالی های موجود در بانک ژن نشان داد که جدایه های مورد مطالعه، دارای بیش از 99% یکنواختی با توالی گونه candidatus phytoplasma solani ثبت شده در بانک ژن می باشند. رسم درخت تبارزایی به روش neighbor-joining با 10000 تکرار، مشخص نمود که جدایه های فایتوپلاسمایی متعلق به گروه stolbur group (16srxii) ازگونه ca. phytoplasma solani می باشند. با توجه به گزارش گونه ca. phytoplasma solani از روی میزبان های دیگر در مرکز ایران، احتمالاً ناقل مشترکی در گسترش این گونه فایتوپلاسمایی نقش دارد.